Relación genética del virus dengue 1 aislado en Cuba durante la epidemia de 1977 / Genetic relationship of dengue virus 1 isolated in Cuba, 1977

Introducción: el dengue es una enfermedad aguda causada por cuatro serotipos del virus del dengue (DENV-1 al 4) y transmitida al hombre por el mosquito Aedes aegypti. En Cuba, la primera epidemia de dengue con confirmación de laboratorio ocurrió en 1977, identificándose al DENV-1 como agente causal. Se plantea que el virus se dispersó en varios países de Latinoamérica y el Caribe partir de su introducción en Jamaica en 1977. Objetivos: explicar la caracterización molecular y determinar la relación genética del DENV-1 aislado en Cuba, 1977. Métodos: a partir de un aislamiento de DENV-1 obtenido en Cuba en el año 1977 conservado en el Banco de Cepas del Laboratorio Nacional de Referencia de Arbovirus (Instituto de Medicina Tropical Pedro Kourí) se realizó la amplificación y secuenciación nucleotídica del gen de la envoltura con cebadores específicos. A partir de la secuencia obtenida se construyó un árbol filogenético de Máxima Verosimilitud, utilizando secuencias de cepas de DENV-1 circulantes a nivel mundial. Resultados: el aislamiento de DENV-1 correspondiente a la epidemia cubana de 1977, se agrupó dentro del genotipo I, relacionándose genéticamente con la cepa de Referencia Hawaii/1943. Es significativo que, el resto de los aislamientos de Latinoamérica de ese mismo período pertenecen al genotipo V, reconocido como el genotipo Americano/Africano. Conclusiones: los resultados del presente trabajo indican que durante la epidemia cubana de 1977 circuló una cepa de DENV-1 del genotipo I, lo que constituye la primera evidencia sobre la presencia de este genotipo en la región de Latinoamérica y el Caribe. No obstante, este hallazgo no descarta la posibilidad de una co-circulación de los genotipos I y V(AU)

Introduction: dengue is an acute disease caused by four dengue virus serotypes (DENV-1 to -4) and transmitted to humans by Aedes aegypti mosquitoes. The first laboratory confirmed dengue epidemic in Cuba occurred in 1977, with DENV-1 as the causative agent. It has been stated that the virus spread to several Latin American and Caribbean countries after being introduced in Jamaica in 1977. Objectives: perform a molecular characterization and determine the genetic relationship of DENV-1 isolated in Cuba in 1997. Methods: Based on a DENV-1 isolate obtained in Cuba in the year 1997 and preserved at the Strain Bank of the National Arbovirus Reference Laboratory (Pedro Kouri Tropical Medicine Institute), nucleotide amplification and sequencing was performed of the envelope gene using specific primers. Starting from the sequence obtained, a maximum likelihood phylogenetic tree was developed using sequences of DENV-1 strains circulating worldwide. Results: the DENV-1 isolate corresponding to the Cuban 1977 epidemic was classed as genotype I and genetically related to the reference strain Hawaii 1943. It is noteworthy that the remaining Latin American isolates from that period belong to genotype V, recognized as the American/African genotype. Conclusions: results show that a DENV-1 strain of genotype I circulated during the Cuban 1977 epidemic. This is the first evidence of the presence of this genotype in the Latin American and Caribbean region. However, this finding does not rule out the possibility of co-circulation of genotypes I and V1(AU)

Títulos de anticuerpos neutralizantes en sueros de individuos posconvalescientes con dengue / Neutralizing antibody titers in sera from patients post-convalescing from dengue

Introducción: la inmunidad del hospedero desempeña un papel importante en determinar el desarrollo de las infecciones por dengue y del cuadro severo de la enfermedad. Sin embargo, otros factores intervienen en el complejo mecanismo de la patogénesis, como la variación entre las cepas virales. Objetivos: evaluación de la capacidad neutralizante de un grupo de sueros de posconvalescientes frente a 2 cepas de dengue 4 pertenecientes a un mismo genotipo. Métodos: se emplearon sueros de 68 individuos con un cuadro de fiebre del dengue y 35 con un cuadro clínico de fiebre hemorrágica del dengue. Resultados: los títulos de anticuerpos neutralizantes en los sueros estudiados fueron bajos y se observó una capacidad neutralizante diferente entre las 2 cepas de dengue 4 del genotipo II. Se observaron diferencias significativas en los títulos de anticuerpos neutralizantes de los sueros procedentes de individuos con infección secundaria y con la forma severa de la enfermedad. Conclusiones: estos resultados demuestran la complejidad de los anticuerpos neutralizantes, que se producen después de una infección por el virus dengue con diferentes cepas de un mismo serotipo, lo cual conduce a obtener resultados diversos por esta técnica que podría ser la causa de la trasmisión continuada de múltiples cepas de dengue.

Introduction: host immunity plays an important role in determining the development of dengue infections and the severe form of the disease. However, other factors, such as the variation between viral strains, are also involved in this complex pathogenesis mechanism. Objectives: evaluate the neutralizing capacity of a number of sera from post-convalescing patients against two dengue 4 strains from the same genotype. Methods: examination was conducted of sera from 68 individuals with dengue fever and 35 with dengue hemorrhagic fever. Results: neutralizing antibody titers were low in the sera analyzed. Different neutralizing capacity was found between the two dengue 4 strains from genotype II. Significant differences were observed between neutralizing antibody titers in sera from individuals with secondary infection and with the severe form of the disease. Conclusions: results reveal the complex nature of the neutralizing antibodies produced after a dengue infection with different strains of the same serotype, leading to diverse results by this technique, which could be the cause of the continued transmission of multiple dengue strains.

Propiedades biológicas de cepas de dengue virus-3 aisladas durante la epidemia ocurrida en La Habana, 2001-2002 / Biological properties of virus dengue-3 strains isolated during the epidemic ocurred in Havana, 2001-2002

Introducción: durante epidemias de dengue ocurridas en Cuba se ha observado de forma reiterada, un incremento de severidad clínica con la progresión de las epidemias en el tiempo, particularmente en infecciones secundarias. Se considera que este incremento pudiera estar relacionado con cambios genéticos del virus circulante. Objetivo: estudiar algunas propiedades biológicas de cepas aisladas en diferentes momentos de la epidemia de La Habana, 2001-2002. Métodos: se estudiaron 9 cepas de dengue virus-3, se evaluó el efecto citopatogénico y el crecimiento viral en las líneas celulares C6/36 HT y Vero, tamaño de las placas virales, sensibilidad a la temperatura, neurovirulencia en ratones lactantes y la influencia del pH en la unión del virus a la célula, así como en el medio de multiplicación de este. Resultados: las cepas de dengue virus-3 resultaron más citopatogénicas en células Vero, sin embargo, en C6/36 HT se obtuvieron títulos superiores. El conjunto de cepas mostró reducción del título viral y del tamaño de placa al aumentar la temperatura y fueron poco neurovirulentas. En cuanto a la unión del virus a la célula, a pH básico se observaron los mejores títulos, mientras que a pH ácido solo se observó el crecimiento de algunas cepas aisladas al final de la epidemia. El medio de multiplicación del virus a pH 6,5-7 favoreció el crecimiento de las cepas del inicio de la epidemia, mientras que las cepas del final tuvieron títulos superiores a pH 7-8. Conclusiones: se pudo comprobar la existencia de cambios fenotípicos entre cepas de diferentes momentos de la epidemia, que pudieran estar asociados con diferencias en cuanto a su adecuación viral o en su potencial virulento. No obstante, algunas de las propiedades biológicas estudiadas sugieren que las cepas de dengue virus-3 son menos virulentas que las cepas cubanas de dengue virus-2 de 1997.

Introduction: during dengue epidemics in Cuba, an increase in clinical severity with the epidemics progression in time, particularly in secondary infections, have been frequently observed. It is considered that this increase could be related with genetic changes in the circulating virus. Objective: to study some biological attributes related to strains isolated at different points of time during the dengue epidemic occurred in Havana city, 2001-2002. Methods: nine DENV-3 strains were studied. Cytopathogenic effect, viral growth in C6/36 HT and Vero cell lines, viral plaque sizes, temperature sensitivity, neurovirulence in newborn mice and pH influence in the binding of the virus and the cell as well as in the multiplication medium were evaluated. Results: DENV-3 strains were more cytopathogenic in Vero Cells. However, higher titres were obtained in C6/36 HT cells. All the strains showed reduction of viral titres and plaque size with temperature increasing and low neurovirulence. Basic pH favoured virus-cell binding whereas acid pH was only permissive for some strains isolated at the end of the epidemic. On the other hand, at pH 6.5-7, the viral multiplication medium favoured the growth of strains isolated at the beginning of the epidemic whereas the growth of those isolated at the endof the epidemic was noticeable at pH 7-8. Conclusions: this study proved the phenotypical changes among strains isolated at different points of time in the epidemic. They might be related to differences in viral fitness or in virulent potential. Nevertheless, some of the studied biological properties suggest that dengue virus-3 strains are less virulent than the Cuban dengue virus 2 strains isolated in 1997.

Propiedades biológicas de cepas de virus dengue serotipo 2 aisladas durante la epidemia en Santiago de Cuba, 1997 / Biological properties of dengue virus serotype 2 strains isolated from the epidemic occurred in Santiago de Cuba in 1997

Introducción: durante la epidemia cubana de dengue ocurrida en Santiago de Cuba, 1997, se evidenció un incremento de la severidad en el tiempo en términos de proporción de casos graves y muertes por dengue hemorrágico, que pudiera estar dado por la aparición de mutantes de escape a la neutralización, con mayor potencial virulento. Objetivos: estudiar algunas propiedades biológicas de cepas aisladas en diferentes momentos de la epidemia de Santiago de Cuba en 1997. Métodos: se estudiaron 9 cepas de DENV-2, se evaluó el efecto citopatogénico y el crecimiento viral en las líneas celulares C6/36 HT y Vero, tamaño de las placas virales, sensibilidad a la temperatura, neurovirulencia en ratones lactantes y la influencia del pH en la unión del virus a la célula, así como en el medio de multiplicación. Resultados: las cepas del final de la epidemia mostraron propiedades que las diferencian de las aisladas al inicio, entre las que se encuentran un mayor efecto citopatogénico en células C6/36 HT, títulos virales superiores y una mayor neurovirulencia en ratones lactantes. Por otra parte, en la unión del virus a la célula las cepas del inicio de la epidemia resultaron favorecidas por un pH ácido mientras que a las cepas del final de la epidemia las favoreció un pH básico. Conclusiones: pudo demostrarse que además de los cambios genotípicos observados previamente, existen diferencias fenotípicas entre cepas de distintos momentos de la epidemia, que pudieran estar asociados con diferencias en cuanto a la adecuación viral de estas y(o) en su potencial virulento.

Introduction: during the Cuban epidemic that occurred in Santiago de Cuba in 1997, there was observed increasing severity in the course of time, in terms of proportion of serious dengue haemorrhagic cases and deaths that could be due to the emergence of escape mutants to neutralization with greater virulent potential. Objective: to study some biological attributes of a group of strains isolated at different points of time during the Santiago de Cuba epidemic in 1997. Methods: nine DENV-2 strains were studied. The cytopathogenic effect, the viral growth in C6/36 HT and VERO cell lines, the virus plaque sizes, the sensitivity to temperatures, the neurovirulence in newborn mice and the influence of the pH in the union of the virus to the cell as well as in the multiplication medium were all evaluated. Results: the strains isolated at the end of the epidemic differed from those of the beginning showing increased neurovirulence in newborn mice and higher viral titers and greater cytopathogenic effect in HT C6/36 cells. On the other hand, the virus and the cell union was favored by acid pH when testing strains from the beginning of the epidemic, whereas this union was favored by the basic PH in the strains isolated at the end of the epidemic Conclusions: the present study managed to show that in addition to the previously observed genotypical changes, there were phenotypical differences among the strains isolated at different points of time in the epidemic; all these aspects may be associated with differences in the viral fitness and/or in the virulent potential of these strains.

Identificación rápida de los serotipos del virus del dengue mediante la reacción en cadena de la polimerasa

Se emplearon 4 juegos de cebadores que permitieron la amplificación de una secuencia nucleotídica con talla única para cada uno de los serotipos del virus del dengue mediante la reacción en cadena de la polimerasa (RCP), con un método que consistió de extracción del ácido ribonucleico (ARN) de sobrenadante de cultivos celulares infectados, transcripción reversa - reacción en cadena de la polimerasa (TR-RCP), todo lo cual pudo ser completado en aproximadamente 7 horas, en un simple tubo. La talla de la secuencia amplificada se evidenció por electroforesis en un gel de agarosa, teñido con bromuro de etidio. El método demostró una sensibilidad de al menos 2,5 unidades formadoras de placa (ufp) por tubo de reacción, siendo útil para la detección e identificación simultánea de los 4 serotipos, a partir de sobrenadante de cultivos infectados de cepas provenientes de varios países del Caribe, América Central y del Sur.

4 primer sets, were used to allow the amplification of a nucleotide sequence with unique size for each of the dengue virus serotypes by polymerase chain reaction (PRC). The method consisted in the extraction of ribonucleic acid from supernatant of infected cell cultures, reverse transcription - polymerase chain reaction (RT-PCR). This was completed in approximately 7 hours in a simple tube. The size of the amplified sequence was evidenced by electrophoresis in Agarose gel stained with ethidium. The method showed a sensitivity of at least 2.5 plate forming units (pfu) per tube of reaction. It es useful for the detection and simultaneous identification of the 4 serotypes, starting from supernatants of infected strains cultures from different countries of the Caribbean, Central America, and South America.